СТАБИЛЬНОСТЬ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ИНУЛАЗЫ ПРИ ЭКСПЛУАТАЦИИ В РЕАКТОРЕ ПЕРИОДИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Кожокина О.М.

Ассистент, кандидат биологических наук

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Россия, г. Воронеж

 

Аннотация. С помощью модифицированного глутаральдегидного метода осуществлена иммобилизация инулазы из Aspergillus awamori  на анионите АВ-26. Выявлено, что эксплуатация препарата в течение 2 лет в реакторе периодического действия сопровождается увеличением его активности на ~30%. Через 3 года активность фермента снижается на ~40%; спустя 4 года применения приближается к нулю.

Ключевые слова: иммобилизованная инулаза, анионит, реактор периодического действия.

 

Актуальность проблемы. Изучение особенностей протекания реакции гидролиза инулина при различных технологических режимах, исследование возможностей длительного использования иммобилизованных ферментов и выявление происходящих при этом изменений в состоянии макромолекул катализатора приобретают в настоящее время особую значимость для разработок новых промышленных линий получения фруктозы [1]. Фруктоза необходима для производства продуктов диетического питания для больных сахарным диабетом, а также с целью профилактики данного заболевания.

Результаты исследований. Известно, что химические методы иммобилизации имеют ряд преимуществ перед адсорбционными. Они способствуют повышению устойчивости фермента к денатурации, обеспечивая стабильную связь, позволяющую эксплуатировать катализатор в течение длительного времени [2]. В качестве носителей удобно использовать ионообменные смолы, так как они полностью соответствуют требованиям безопасности.

С помощью модифицированного глутаральдегидного метода была осуществлена иммобилизация инулазы (2,1-β-D-фруктанфруктаногидролазы, КФ 3.2.1.7) из Aspergillus awamori BKMF 2250 на ионообменной смоле АВ-26.

Показано, что ковалентно связанный с ионитом фермент сохраняет 78% от активности свободной инулазы; содержание белка составляет 2,2 мг/г препарата.

При ковалентной иммобилизации на анионите происходит фиксация третичной структуры путем взаимодействия между активными группами носителя и фермента, что сопровождается повышением жесткости третичной структуры.

С помощью метода ИК-спектроскопии показано, что спектр иммобилизованной инулазы характеризуется наличием полосы поглощения в области амид II с максимумом при 1510 см-1.это может свидетельствовать о том, что процесс иммобилизации осуществляется за счет амидных групп концевых и основных аминокислот молекулы фермента.

При образовании комплекса инулаза-анионит происходит сужение полосы поглощения при 3200-3493 см-1, которое характерно колебаниям аминогрупп ионообменника АВ-26.

Смещение полосы поглощения в области 1621-1650 см-1 показывает, что происходит растяжение С=О связи при модификации носителя с глутаровым диальдегидом. Вклад в деформацию связи С=О также вносит образование ковалентной связи между амидными группами фермента и альдегидными группировками модифицированного носителя, о чем свидетельствуют деформационные изменения связи N-H в области 3290-3300 см-1.

Также имеет место поглощение при 1612 см-1 и 1560 см-1, которые характеризуют деформационные колебания NH-групп в имидазольном цикле и СОО-групп в радикалах глутаминовой и аспарагиновой кислот.

Анализ содержания типов вторичной структуры указывает на повышение упорядоченности структуры иммобилизованной инулазы. Обнаружено, что протяженность нерегулярных участков уменьшается в 2 раза, в 3 раза увеличивается длина β-слоев, а количество α-спиралей становится в 2 раза меньше.

Таким образом установлено, что иммобилизация инулазы на анионите АВ-26 способствует стабилизации ферментного препарата. Это позволяет предположить возможность длительного использования для осуществления реакции гидролиза инулина.

Показано, что эксплуатация препарата иммобилизованной инулазы в течение 2 лет в реакторе периодического действия (лабораторные условия) c целью гидролиза инулина до фруктозы сопровождается увеличением каталитической активности фермента на ≈30%. Вероятно, наблюдаемый эффект обусловлен ослаблением диффузионных затруднений доступа молекул субстрата к функциональным группам активного центра инулазы, что связано с частичным разрушением структуры носителя, изменением степени пористости ионита.

После 3 лет эксплуатации в реакторе периодического действия активность иммобилизованной инулазы снизилась на ≈40% от исходной, после 4 лет использования препарат характеризовался наличием остаточной биокаталитической способности. Очевидно, происходит практически полный разрыв ковалентных связей между молекулами фермента и матрицей носителя, т.е. разрушение иммобилизованного препарата как такового.

Вывод. Иммобилизация инулазы модифицированным глутаральдегидным методом позволяет использовать ферментный препарат в реакторе периодического действия многократно; срок хранения препарата – 3 года.

Список литературы:

1. Шкутина И.В. Гидролиз инулина с помощью гетерогенных биокатализаторов / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев // Химия растительного сырья. – 2012. - № 2. – С. 27-31.

2. Шкутина И.В. Влияние ионной формы полиамфолита АНКБ-2 на иммобилизацию ферментов / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.В. Лунина // Сорбционые и хроматографические процессы. – 2009. – Т.9, вып. 2. – С. 247-253.

Сведения об авторе:

Кожокина Оксана Михайловна – кандидат биолоических наук, ассистент кафедры биохимии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко, Россия, г. Воронеж

 

IMMOBILIZED INULASE STABILITY WHILE EXPLOITING IN THE BATCH REACTOR

Kozhokina O.M.

Abstract. Inulase immobility is carried out with glutaraldehyde method from Aspergillus awamori  on the anionite AV-26. It is found out that exploitation of the agent in the batch reactor for 2 years is accompanied by the increase of activity in 30%. In 3-year period enzyme activity reduces in 40%; in four years – reaches zero value.

Keywords: immobilized inulase, anionite, the batch reactor.

References:

1. Shkutina I.V. Hydrolysis of inulin on hand of heterogeneous biocatalysts / I.V. Shkutina, O.F. Stoyanova, V.F. Selemenev // Chemistry of plant raw materials. -2012. -№ 2. -P. 27-31.

2. Shkutina I.V. Influence of ionic forms polyampholyte ANKB-2 on the immobilization of enzymes / I.V. Shkutina, O.F. Stoyanova, V.V. Lunina // Sorption and chromatographic process. -2009. -V. 9, № 2. -P. 247-253.